第一節  大規模培養技術應用簡介

通過大規模體外培養技術培養哺乳類動物細胞是生產生物制品的有效方法。20世界60-70年代，就已創立了可用于大規模培養動物細胞的微載體培養系統和中空纖維細胞培養技術。近十數年來，由于人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細胞介素等生物制品的需求猛增，以傳統的生物化學技術從動物組織獲取生物制品已遠遠不能滿足這一需求。隨著細胞培養的原理與方法日臻完善，動物細胞大規模培養技術趨于成熟。

所謂動物細胞大規模培養技術（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設定ph、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養動物細胞用于生產生物制品的技術。目前可大規模培養的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、cho（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依賴的成纖維細胞)等，并已成功生產了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產品。

在過去幾十年來，該技術經有了很大發展，從使用轉瓶(roller bottle) 、CellCube等貼壁細胞培養，發展為生物反應器（Bioreactor）進行大規模細胞培養。第一代細胞培養技術核心問題是難以產業化或者說是規模化生產：一是在工藝生產時不能大規模制備產品；二是非批量生產容易導致產品質量的不均一性；三是難以對同批生產進行生產和質量控制。

隨著生物技術的發展，迫切需要大規模的細胞培養，特別是培養表達特異性蛋白的哺乳動物細胞，以便獲得大量有用的細胞表達產物。采用玻璃瓶靜置或旋轉瓶的培養方法，已不能滿足所需細胞數量及其分泌產物。因而必須為工業化生產開創一種新的技術方法。自70年代以來，細胞培養用生物反應器有很大的發展，種類越來越多，規模越來越大，較常見的細胞培養生物反應器有空氣提升反應器，中空纖維管反應器，無泡攪拌反應器及籃式生物反應器等。八十年代以來，人們逐漸開始以生物反應器培養代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。

動物細胞是一種無細胞壁的真核細胞，生長緩慢，對培養環境十分敏感。采用傳統的生物化工技術進行動物細胞大量培養，除了要滿足培養過程必需的營養要求外，有必要建立合理的控制模型，進行pH和溶氧（DO）的最佳控制。細胞生物反應器可通過微機有序地定量地控制加入動物細胞培養罐內的空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳四種氣體的流量，使其保持最佳的比例來控制細胞培養液中的pH值和溶氧水平，使系統始終處于最佳狀態，以滿足動物細胞的生長對pH值和溶解氧的需要。如為提高或達到一定的溶氧水平可改變通入培養罐內氣體中氧氣和氮氣的比例來實現控制DO值的目的。采用二氧化碳/碳酸氫鈉（CO2/NaHCO3）緩沖液系統來控制培養液的pH值是一種較好的方法。

現在，由于動物細胞培養技術在規模和可靠性方面都不斷發展，且從中得到的蛋白質也被證明是安全有效的，因此人們對動物細胞培養的態度已經發生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質藥物和疫苗，尤其是那些相對較大、較復雜或糖基化（glycosylated）的蛋白質來說，動物細胞培養是首選的生產方式。60年代初，英國AVRI研究所在貼壁細胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養成功后，從最初的200ml和800ml玻璃容器開始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養規模。使用的是基于Eagle's配方的培養基，補充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后，Wellcome（現為Cooper動物保健）集團分布于歐洲、非洲和南美洲8個國家的生產廠商，應用此項技術工業規模化生產口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，已掌握了5000L的細胞罐大規模培養技術。

目前已實現商業化的產品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動物細胞大規模培養方法生產的主要產品之一。1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用動物細胞進行大規模培養生產口蹄疫疫苗。美國Genentech公司應用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動物細胞內進行高效表達，已生產出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司采用8000L Namalwa細胞生產α干擾素。英國Celltech公司用氣升式生物反應器生α、β和γ干擾素；用無血清培養液在10000L氣升式生物反應器中培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反應器大規模培養動物細胞生產出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等。

第二節 大規模培養常用方法

根據動物細胞的類型，可采用貼壁培養、懸浮培養和固定化培養等三種培養方法進行大規模培養。

一、動物細胞生長特性及培養溫度

1.細胞生長緩慢，易污染，培養需用抗生素
2.細胞大，無細胞壁，機械強度低，環境適應性差
3.需氧少，不耐受強力通風與攪拌
4.群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性）
5.培養過程產品分布細胞內外，成本高
6.原代培養細胞一般繁殖50代即退化死亡

依據在體外培養時對生長基質依賴性差異，動物細胞可分為兩類：

●貼壁依賴型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。

●非貼壁依賴型細胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉化細胞。
培養細胞的最適溫度相當于各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養的最適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡。總的來說，培養細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培養置于39~40℃環境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復；當溫度達43℃以上時，許多細胞將死亡。當溫度下降到30~20℃時，細胞代謝降低，因而與培養基之間物質交換減少。首先看到的是細胞形態學的改變以及細胞從基質上脫落下來。當培養物恢復到初始的培養溫度時，它們原有的形態和代謝也隨之恢復到原有水平。

二、貼壁培養（attachment culture）是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養。

1.生長特性：貼壁依賴型細胞在培養時要貼附于培養（瓶）器皿壁上，細胞一經貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數生長期。一般數天后就鋪滿培養表面，并形成致密的細胞單層。

2.貼壁培養的優點：
●容易更換培養液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養液，清洗后直接加入新培養液。
●容易采用灌注培養，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統。
●當細胞貼壁于生長基質時，很多細胞將更有效的表達一種產品。
●同一設備可采用不同的培養液/細胞的比例。
●適用于所有類型細胞。

3.貼壁培養的缺點：與懸浮培養法相比
●擴大培養比較困難，投資大；
●占地面積大；
●不能有效監測細胞的生長；

4.細胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。

5.貼壁培養系統：主要有轉瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統（后面介紹）等。

●轉瓶培養系統：培養貼壁依賴型細胞最初采用轉瓶系統培養。轉瓶培養一般用于小量培養到大規模培養的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。細胞接種在旋轉的圓筒形培養器-轉瓶中，培養過程中轉瓶不斷旋轉，使細胞交替接觸培養液和空氣，從而提供較好的傳質和傳熱條件。

轉瓶培養具有結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，放大只需簡單的增加轉瓶數量等優點。

但也有其缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養時監測和控制環境條件受到限制等。

現在使用的轉瓶培養系統包括二氧化碳培養箱和轉瓶機兩類。

●反應器貼壁培養 此種培養方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養液一起流動，因此比較容易更換培養液，不需要特殊的分離細胞和培養液的設備，可以采用灌流培養獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產品；但擴大規模較難，不能直接監控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。

CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器是常用的貼壁培養式生物反應器，用于細胞貼壁培養時可用籃式攪拌系統和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細胞密度。籃式攪拌系統和載體培養是目前貼壁細胞培養使用最多方式，用于雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培養。此種方式培養細胞，細胞接種后貼壁快。

三、懸浮培養（suspension culture）：是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養，如雜交瘤細胞等；是在微生物發酵的基礎上發通起來的。

無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養方式，它能減少后期純化工作，提高產品質量，正逐漸成為動物細胞大規模培養的研究新方向。

四、固定化培養（immobilization culture）：是將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進行培養。上述兩大類細胞都適用，具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優點，細胞易于產物分開，有利于產物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯法、包埋法、微囊法等。

1.吸附法:用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中較早研究使用的方法。缺點是：載體的負荷能力低，細胞易脫落。微載體培養和中空纖維培養是該方法的代表，稍后專門介紹。

2.共價貼附法:利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細胞的泄漏，但須引入化學試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而導致擴散限制小，細胞得不到保護。

3. 離子/共價交聯法:雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結產生交交聯作用，此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯法（cross-linking by covalent bonding）。交聯試劑會使一些細胞死亡，也會產生擴散限制。

4.包埋法:將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優點是：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點是：擴散限制，并非所有細胞都處于最佳基質濃度，且大分子基質不能滲透到高聚物網絡內部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。

5.微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜；囊內是種微小培養環境，與液體培養相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應注意：

●溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；
●所用試劑和膜材料對細胞無毒害；
●膜的孔徑可控制，必須使營養物和代謝物自由通過；
●膜應有足夠機械強度抵抗培養中攪拌。

五、抗凋亡策略在細胞大規模培養中的應用

生物反應器動物細胞大規模生產過程中，細胞凋亡在細胞死亡中占主要部分。研究顯示在大規模培養生物反應器中細胞的死亡中80%是凋亡所導致,而不是以前所認為的壞死。而在大規模細胞培養中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的障礙。理論上講，防止或延長細胞死亡，可以極大提高生物反應器生產重組蛋白的產量。

細胞凋亡由一系列基因精確地調控，是多細胞生物發育和維持穩態所必需的生理現象。已知凋亡的最終執行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識別一個4氨基酸序列，并在識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識別的序列，可以切割活化自身而導致信號放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級聯放大，最終作用于效應蛋白，引起細胞凋亡。

所以在大規模培養時干擾細胞在培養中凋亡的發生，提高細胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力，有利于提高細胞的培養密度、延長細胞的培養周期，從而提高目標產品的產量2-3倍。

1.營養物質抗凋亡
在常規生物反應器構造中，營養耗竭或缺乏培養基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養基中添加氨基酸或其它關鍵營養可抑制凋亡、延長培養時間從而提高產品的生產。大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時，細胞變得更為脆弱，更容易發生凋亡。

2.基因抗凋亡
與凋亡相關的一系列基因產物可對其進行正、負向的調控，因此可通過導入相應基因來調節細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前 有效的抗凋亡基因，在多種細胞系中均表現出很強的抗凋亡活性。

3.化學方法抗凋亡
凋亡發生時細胞許多部位發生生化物質的改變，有些變化如改變細胞氧化還原條件產生活性氧在凋亡信號階段發生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發生在凋亡效應階段，這在絕大多數細胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質的改變可能阻止或至少延遲細胞凋亡的發生，運用化學物質可抑制信號效應階段的發生，被認為是抗調亡策略之一。
大規模培養技術的操作方式

深層培養可分為：分批式、流加式、半連續式、連續式、連續式和灌注式五種。

一、分批式培養（batch culture） 是細胞規模培養發展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎。該方式采用機械攪拌式生物反應器，將細胞擴大培養后，一次性轉入生物反應器內進行培養，在培養過程中其體積不變，不添加其它成分，待細胞增長和產物形成積累到適當的時間，一次性收獲細胞、產物、培養基的操作方式。

該方式的特點:
●操作簡單。培養周期短，染菌和細胞突變的風險小。反應器系統屬于封閉式，培養過程中與外部環境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進行其他任何控制，因此操作簡單，容易掌握；
●直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養環境，不添加任何營養成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎條件或"小試"研究常用的手段；
●可直接放大。由于培養過程工藝簡單，對設備和控制的要求較低，設備的通用性強，反應器參數的放大原理和過程控制，比較其它培養系統較易理解和掌握，在工業化生產中分批式培養操作是傳統的、常用的方法，其工業反應器(Genetech)規模可達12000L。

分批培養過程中，細胞的生長分為五個階段：延滯期、對數生長期、減速期、平穩期和衰退期，見圖1。分批培養的周期時間多在3-5天，細胞生長動力學表現為細胞先經歷對數生長期（48-72h）細胞密度達到最高值后，由于營養物質耗劫或代謝毒副產物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡，表現出典型的生長周期。收獲產物通常是在細胞快要死亡前或已經死亡后進行。

二、流加式培養（feeding culture）

1.流加式培養是在批式培養的基礎上，采用機械攪拌式生物反應器系統，懸浮培養細胞或以懸浮微載體培養貼壁細胞，細胞初始接種的培養基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培養過程中根據細胞對營養物質的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養物或培養基，從而使細胞持續生長至較高的密度，目標產品達到較高的水平，整個培養過程沒有流出或回收，通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。

2.流加培養特點：
●流加培養根據細胞生長速率、營養物消耗和代謝產物抑制情況，流加濃縮的營養培養基。流加的速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應的流加過程，保證合理的培養環境與較低的代謝產物抑制水平。
●培養過程以低稀釋率流加，細胞在培養系統中停留時間較長，總細胞密度較高，產物濃度較高。
●流加培養過程須掌握細胞生長動力學，能量代謝動力學，研究細胞環境變化時的瞬間行為。流加培養細胞培養基的設計和培養條件與環境優化，是整個培養工藝中的主要內容。
●在工業化生產，懸浮流加培養工藝參數的放大原理和過程控制，比較其它培養系統較易理解和掌握，可采用工藝參數的直接放大。

流加培養是當前動物細胞培養中占有主流優勢的培養工藝，也是近年來動物細胞大規模培養研究的熱點。流加培養中的關鍵技術是基礎培養基和流加濃縮的營養培養基。通常進行流加的時間多在指數生長后期，細胞在進入衰退期之前，添加高濃度的營養物質。可以添加一次，也可添加多次，為了追求更高的細胞密度往往需要添加一次以上，直至細胞密度不再提高；可進行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進行添加，但為了盡可能的維持相對穩定的營養物質環境，后者采用較多；添加的成分比較多，凡是促細胞生長的物質均可以進行添加。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩定的培養環境，營養成分即不過剩而產生大量的代謝副產物造成營養利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導致細胞生長抑制或死亡。

3.流加工藝中的營養成分主要分為三大類：

●葡萄糖：葡萄糖是細胞的供能物質和主要的碳源物質，然而當其濃度較高是會產生大量的代謝產物乳酸，因而需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳。
●谷氨酰胺：谷氨酰胺是細胞的供能物質和主要的氮源物質，然而當其濃度較高是會產生大量的代謝產物氨，因而也需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳；
大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時，細胞變得更為脆弱，更容易發生凋亡。
●氨基酸、維生素及其他：主要包括營養必需氨基酸、營養非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養成分如膽堿、生長刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續流加。
4.流加式培養分為兩種類型：單一補料分批式培養和反復補料分批式培養。
●單一補料分批式培養是在培養開始時投入一定量的基礎培養液，培養到一定時期，開始連續補加濃縮營養物質，直到培養液體積達到生物反應器的最大操作容積，停止補加，最后將細胞培養液一次全部放出。該操作方式受到反應器操作容積的限制，培養周期只能控制在較短的時間內。
●反復補料分批式培養是在單一補料分批式操作的基礎上，每個一定時間按一定比例放出一部分培養液，是培養液體積始終不超過反應器的最大操作容積，從而在理論上可以延長培養周期，直至培養效率下降，才將培養液全部放出。

三、半連續式培養（semi-continuous culture）

1.半連續式培養又稱為重復分批式培養或換液培養。采用機械攪拌式生物反應器系統，懸浮培養形式。在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養物，再用新的培養液補足到原有體積，使反應器內的總體積不變。

這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養基，讓其生長至一定的密度，在細胞生長至最大密度之前，用新鮮的培養基稀釋培養物，每次稀釋反應器培養體積的1/2~3/4，以維持細胞的指數生長狀態，隨著稀釋率的增加培養體積逐步增加。或者在細胞增長和產物形成過程中，每隔一定時間，定期取出部分培養物，或是條件培養基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養基繼續進行培養的一種操作模式。剩余的培養物可作為種子，繼續培養，從而可維持反復培養，而無需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養環境和相當高的接種量，經過幾次的稀釋、換液培養過程，細胞密度常常會提高。

2.半連續式特點：
●培養物的體積逐步增加；
●可進行多次收獲；
●細胞可持續指數生長，并可保持產物和細胞在一較高的濃度水平，培養過程可延續到很長時間。
該操作方式的優點是操作簡便，生產效率高，可長時期進行生產，反復收獲產品，可使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養和藥品生產中被廣泛應用。

四、連續式培養（continuous culture）

1.連續式培養是一種常見的懸浮培養模式，采用機械攪拌式生物反應器系統。該模式是將細胞接種與一定體積的培養基后，為了防止衰退期的出現，在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反應器連續添加新鮮培養基；同時，含有細胞的培養物以相同的速度連續從反應器流出，以保持培養體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續下去。

2.連續培養的優點是反應器的培養狀態可以達到恒定，細胞在穩定狀態下生長。穩定狀態可有效的延長分批培養中的對數生長期。在穩定狀態下細胞所處的環境條件如營養物質濃度、產物濃度、pH值可保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可維持不變。細胞很少受到培養環境變化帶來的生理影響，特別是生物反應器的主要營養物質葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細胞和細胞碎片及時清除，細胞活性高最終細胞密度得到提高；可是產物卻不斷在稀釋，因而產物濃度并為提高；尤其是細胞和產物不斷的稀釋，營養物質利用率、細胞增長速率和產物生產速率低下。

3.連續式培養不足：
●由于是開放式操作，加上培養周期較長，容易造成污染；
●在長周期的連續培養中，細胞的生長特性以及分泌產物容易變異；
●對設備、儀器的控制技術要求較高。
連續式培養操作使用的反應器多數是攪拌式生物反應器，也可以是管式反應器。

4.連續式培養的特點：
●細胞維持持續指數增長；
●產物體積不斷增長；
●可控制衰退期與下降期。

五、灌流式培養（perfusion culture）

1.灌流式培養是把細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，不斷地將部分條件培養基取出，同時又連續不斷地灌注新的培養基。它與半連續式操作的不同之處在于取出部分條件培養基時，絕大部分細胞均保留在反應器內，而半連續培養在取培養物時同時也取出了部分細胞。

灌流式培養常使用的生物反應器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應器懸浮培養細胞，這種反應器必須具有細胞截流裝置，細胞截留系統開始多采用微孔膜過濾或旋轉膜系統，最近開發的有各種形式的沉降系統或透析系統。

中空纖維生物反應器是連續灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產物和底物，截流細胞和分子量較大的產物，在連續灌流過程中將絕大部分細胞截留在反應器內；近年來中空纖維生物反應器被廣泛應用于產物分泌性動物細胞的生產，主要用于培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體。

另外一種形式是固定床或流化床生物反應器，固定床是在反應器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產生的負壓，迫使培養基不斷流經填料，有利于營養成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長。流化床生物反應器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態進行反應，適合于固定化細胞的培養。

2.灌流式培養的優點：
●細胞截流系統可使細胞或酶保留在反應器內，維持較高的細胞密度，一般可達107-109/ml，從而較大的提高了產品的產量；
●連續灌流系統，使細胞穩定的處在較好的的營養環境中，有害代謝廢物濃度積累較低；
●反應速率容易控制，培養周期較長，可提高生產率，目標產品回收率高；
●產品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產品的活性。

連續灌注培養是近年用于動物細胞培養生產分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應用連續灌流工藝的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法的困難是污染機率較高，長期培養中細胞分泌產品的穩定性，規模放大過程中工程問題。

六、細胞工廠培養 細胞工廠(cell factory)是一種設計精巧的細胞培養裝置。它在有限的空間內利用了培養表面，從而節省了大量的廠房空間,并可節省貴重的培養液。更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務和時間損失。它是對傳統轉瓶培養的革命。

丹麥NUNC公司生產的NUNC細胞工廠是目前應用較多的細胞工廠系統。可用于如疫苗、單克隆抗體或生物制藥等工業規模生產，特別適合于貼壁細胞，也可用于懸浮培養，在從實驗室規模進行放大時不會改變細胞生長的動力學條件，可提供1，2，10和40盤的規格使放大變得簡單易行，低污染風險，節省空間，培養表面經測試保證有利于細胞貼附和生長。同時，與NUNC的細胞工廠操作儀結合使用，可全面實現細胞培養的自動化，從而大大地減低勞動強度和密集度。

這套系統使用很方便，可產生類似塑料培養瓶的效果。由組織培養級聚笨乙烯制成，使用后可隨意處理。其缺點是：經胰酶消化后，很難將細胞完全洗出。

第四節 動物細胞大規模培養用生物反應器簡介

動物細胞培養技術能否大規模工業化、商業化，關鍵在于能否設計出合適的生物反應器（bioreactor）。由于動物細胞與微生物細胞有很大差異，傳統的微生物反應器顯然不適用于動物細胞的大規模培養。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態下，能夠提供充足的氧以供細胞生長及細胞進行產物的合成。

一、生物反應器分類

目前，動物細胞培養用生物反應器主要包括：轉瓶培養器、塑料袋增殖器、填充床反應器、多層板反應器、螺旋膜反應器、管式螺旋反應器、陶質矩形通道蜂窩狀反應器、流化床反應器、中空纖維及其它膜式反應器、攪拌反應器、氣升式反應器等。

按其培養細胞的方式不同，這些反應可分為以下三類：

1.懸浮培養用反應器：如攪拌反應器、中空纖維反應器、陶質矩形通道蜂窩狀反應器、氣升式反應器；

2.貼壁培養用反應器：如攪拌反應器（微載體培養）、玻璃珠床反應器、中空纖維反應器、陶質矩形通道蜂窩狀反應器；

3.包埋培養用反應器：如流化床反應器、固化床反應器。

二、攪拌罐生長反應器 這是經典、早期就被采用的一種生物反應器。此類反應器與傳統的微生物生物反應器類似，真對動物細胞培養的特點，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細胞和養分在培養液中均勻分布，使養分充分被細胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞。現已開發的有：籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器、海般式攪拌器等。

三、氣升式生物反應器

1979年首次應用氣升式生物反應器成功的進行了動物細胞的懸浮培養。氣升式生物反應器的話優點：
●罐內液體流動溫和均勻，產生剪切力小，對細胞損傷較小；
●可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；
●液體循環量大，細胞和養分都能均勻分布于培養液中；
●結構簡單，利于密封并降低了造價。

常用的氣升式反應器有三種：內循環式氣升式、外循環式氣升式、內外循環式氣升式生物反應器。

四、鼓泡式生物反應器

與氣升式反應器相類似，是利用氣體鼓泡來進行供氧及混合，其設計原理與氣升式生物反應器也相同。

五、中空纖維生物反應器 用途較廣，既可用于懸浮細胞的培養，又可用于貼壁細胞的培養。其原理是：模擬細胞在體內生長的三維狀態，利用反應器內數千根中空纖維的縱向布置，提供細胞近似生理條件的體外生長微環境，使細胞不斷生長。中空纖維是一種細微的管狀結構，管壁為極薄的半透膜，富含毛細管，培養時纖維管內灌流充以氧氣的無血清培養液，管外壁則供細胞黏附生長，營養物質通過半透膜從管內滲透出來供細胞生長；對于血清等大分子營養物，劃必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細胞利用；細胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內，避免了過量代謝物對細胞的毒害作用。

優點是：
●占地空間少；
●細胞產量高，細胞密度可達109數量級；
●生產成本低，且細胞培養維持時間長，適用于長期分泌的細胞。

六、生物反應器的設計和放大 設計的總體考慮是：
①結構嚴密，能耐受蒸汽滅菌，采用對生物催化劑無害和耐蝕材料制作，內壁光滑無死角，內部附件盡量減少，以維持純種培養需要；
②有良好的氣-液接觸和液-固混和性能和熱量交換性能，使質量與熱量傳遞有效地進行；
③保證產物質量和產量前提下，盡量節省能源消耗；
④減少泡沫產生，或附有消沫裝置以提高裝料系數，并有必要可靠的參數檢測和控制儀表并能與計算機聯機。

生物反應器的放大一種新的生物技術產品從實驗室到工業生產的開發過程中，會遇到生物反應器的逐級放大問題，每一級約放大10～100倍。生物反應器的放大，表面看來僅是一個體積或尺度放大問題，實際上并不是那么簡單。

反應器放大研究雖已提出了不少方法，但還沒有一種是普遍都能適用的。目前還只能是半理論半經驗的，即抓住反應過程中的少量關鍵性參數或現象進行放大。

有關氧傳遞問題在生物反應器中，氧的傳遞速率要滿足細胞對氧的攝取速率，并使反應器中溶解氧的濃度CL要維持在一定水平上。這就是說，在穩態情況下，供氧與需氧間存在下列關系：KLa(C*-CL)=r

此處， KLa為氧的傳遞系數；C*為相當氣相氧分壓的溶氧濃度，CL為培養液中溶氧濃度，r為攝氧率。

影響供氧的因素從上式可知r=KLa(C*-CL)；因此影響供氧的因素總體上講是KLa和C*-CL值。

要增大C*-CL，無非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施，有適當增加反應器中操作壓力和增大氣相中的氧分壓兩個方法。在實際操作中，反應器保持一定正壓，以防止大氣中的雜菌從軸封、閥門等處侵入，但在增加罐壓的同時，發酵代謝所產生的CO2也會更多地溶解于培養液而對發酵不利。至于CL值，一般不允許過分減小，因為細胞在生長中有一個臨界氧濃度，低于此臨界值，細胞的呼吸將受到抑制。

影響KLa的因素大致可分為三個方面：一是反應器的結構，包括相對幾何尺寸的比例；二是操作條件，如攪拌功率或循環泵功率的輸入量，通氣量等；三是培養或發酵液的物理化學性質，如流變特性，特別是其粘度或顯示粘度、表面張力、擴散系數、細胞形態、泡沫程度等。

生物反應器中的傳熱在細胞培養和發酵過程中，熱量的釋放是普遍存在的。這是因為在培養或發酵過程中細胞與周圍環境的物質產生新陳代謝，即發生異化（分解）作用和同化（合成）作用，而異化作用一般釋放能量，同化作用則是吸收能量。同化作用包括細胞生長、繁殖、產物形成所需能量來自細胞對培養基中的基質及營養成分的異化。從熱力學角度講，異化所產生能量必然應多于同化所需要能量，而多余的能量則轉化為熱能釋放到周圍環境中去。無論是涉及細胞或酶的反應中，釋放出的熱量都應及時移去，以免影響過程的正常進行，為此在生物反應器中一般都附有冷卻裝置。

第五節 微載體培養技術（microcarrier culture technique）

一、微載體培養應用 此技術于1967年被用于動物細胞大規模培養。經過三十余年的發展，該技術目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應用于生產疫苗、基因工程產品等。微載體培養是目前公認的有發展前途的一種動物細胞大規模培養技術，其兼具懸浮培養和貼壁培養的優點，放大容易。目前微載體培養廣泛用于培養各種類型細胞，生產疫苗、蛋白質產品，如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞。

使用較多的反應器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT?B反應器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器，使用Cell-lift雙篩網攪拌系統。兩種系統都能實現培養細胞和收獲產物的有效分離。

二、微載體 是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一種微載體問世以來，國際市場上出售的微載體商品的類型已經達十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

●微載體的大小：增大單位體積內表面積（S/F）對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。
●微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。
●微載體的表面電荷：據研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產生“毒性”效應。

三、微載體培養原理與操作

1.原理：其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。

貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

2. 攪拌轉速：由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停；數小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉速，進入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢，最大速度75r/min。

3.細胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質有關。一般細胞在進入生理PH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。

4. 細胞在微載體表面的生長 影響細胞在微載體表面生長的因素很多，主要有三個方面。

●在細胞方面，如細胞群體、狀態和類型。
●在微載體方面，如微載體表面狀態、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。
●在培養環境中，如培養基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件合適，則細胞生長快；反之生長速度慢。

5. 微載體培養操作要點

●培養初期：保證培養基與微球體處于穩定的PH與溫度水平，接種細胞（對數生長期，而非穩定期）至終體積1/3的培養液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環境或經常換液。
●貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質混合。
●培養維持期：進行細胞計數（胞核計數）、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢。隨意細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經過3d左右，培養液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養液，緩慢加入新鮮培養液（37℃），重新開始攪拌。
●收獲細胞：首先排干培養液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細胞及其產品。
●微載體培養的放大：可以通過增加微載體的含量或培養體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養生產疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。

四、微載體大規模細胞培養的生物反應器系統 此技術大規模培養，細胞擴增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括：細胞對剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴大培養等。而研制的各種類型生物反應器系統則可針對上述限制性因素，為微載體細胞培養與擴增提供低剪切力、高氧傳遞效率、易于細胞傳代等適宜的外部環境。已較多使用的微載體培養系統生物反應器，可以實行計算機控制操作，培養攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、PH穩定及溶氧供應（O2、N2、CO2、空氣四種純化氣體按比例調節）、罐壓、培養體積和通氣量等參數全部由電腦自動控制。因此，應用生物反應器系統進行微載體細胞大規模擴增具有明顯優勢，目前國外相繼研制了數種適合進行微載體大規模細胞培養的生物反應器系統，如攪拌式生物反應器系統、旋轉式生物反應器系統以及灌注式生物反應器系統等。

1、攪拌式生物反應器系統 攪拌式生物反應器系統在微載體細胞大規模擴增研究領域已有較長的研究歷史，但因該細胞培養系統容易產生過大的剪切力，從而限制了其應用范圍。盡管如此，由于該系統具有簡單、實用及價格低廉等特點，國內外仍有不少應用該系統成功進行細胞大規模擴增的研究報道。例如，Werner A（2000年）成功地在該系統內進行了肝細胞大規模擴增的研究。

2、灌注式生物反應器系統 灌流培養是目前研究熱點之一。它的特點是不斷地加入新鮮培養基以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的消耗培養基，使細胞得以在一個相對穩定的生長環境內增殖，即省時省力，又減少了細胞發生污染的機會，且可以提高細胞密度10倍以上。

3、旋轉生物反應器 近年來，旋轉生物反應器系統（RCCS）已經成為應用微載體技術進行細胞大規模擴增的一種較常用細胞培養系統。該系統是基于美國航空航天局為模擬空間微重力效應而設計的一種生物反應器。RCCS既可以用于微載體大規模細胞培養，又能在其內培育細胞與支架形成的三維空間復合體。至今，近百種組織細胞均在該系統內成功進行了大規模擴增。

五、微載體培養優點

●表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養液的細胞產率高；
●把懸浮培養和貼壁培養融合在一起，兼有兩者的優點；
●可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況；
●簡化了細胞生長各種環境因素的檢測和控制，重現性好；
●培養基利用率較高；
●放大容易；
●細胞收獲過程不復雜；
●勞動強度小；
●培養系統占地面積和空間小。